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傳代培養(yǎng)的方法及其注意事項(xiàng)
更新時(shí)間:2025-05-09 點(diǎn)擊量:162

傳代培養(yǎng)的方法及其注意事項(xiàng)

原理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后,已基本上飽和,為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng),同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大,就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以,而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料和試劑
1. 細(xì)胞:貼壁細(xì)胞株
2. 試劑:0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清)
3. 儀器和器材:倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
操作步驟
1. 吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
2. 向瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許,以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中2~5分鐘,當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大后,立即終止消化。
4. 吸除消化液,向瓶?jī)?nèi)注入Hanks液數(shù)毫升,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細(xì)胞時(shí),動(dòng)作要輕,以免把已松動(dòng)的細(xì)胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液?jiǎn)为?dú)消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液沖洗,直接加入培養(yǎng)液。
5. 用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。
6. 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中,置溫箱中培養(yǎng)。
無(wú)菌操作注意事項(xiàng) 
1. 操作前要洗手,進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2. 點(diǎn)燃酒精燈,操作在火焰附近進(jìn)行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng),以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3. 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動(dòng),增加污染機(jī)會(huì)。
4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺(tái)面上用品要布局合理。
5. 瓶子開(kāi)口后要盡量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。                                

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